尊龙凯时在细胞培养领域提供了一系列详尽的指南,以确保细胞的健康和有效繁殖。以下是关于细胞培养的基本条件和操作流程。
培养条件
细胞生长环境包括气相和培养基两部分。气相应保持在95%空气与5%二氧化碳的比例,温度设定为37℃。所用的培养基为MEM,添加10%FBS和1%P/S以支持细胞的生长。
传代方法
细胞的第一次传代一般建议按照1:2的比例进行。传代时,若细胞汇合度未超过80%,可将培养液收集至离心管,保留5ml培养基,并放入37℃的细胞培养箱进行培养;如果细胞密度超过80%,则可直接进行传代。
细胞培养步骤
1. 清除培养上清液,用不含钙镁的PBS洗涤细胞1-2次;
2. 添入0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml,置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞变圆和脱落的情况,若大部分细胞已脱落,加入5ml完全培养基终止消化;
3. 轻轻吹打使细胞完全脱落,并将悬液转移至离心管,在1000RPM下离心5分钟,弃去上清,重悬细胞并补加1-2ml完全培养基;
4. 按照1:2的比例进行分瓶传代,补充新的完全培养基至每个瓶中5-8ml,最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
细胞冻存
当细胞覆盖T25培养瓶的80%面积时,需进行冻存处理。操作步骤如下:
1. 弃去培养液,用PBS清洗细胞;
2. 添入0.25%胰蛋白酶消化液,轻轻观察,待细胞回缩并变圆后终止消化,轻轻吹打细胞,转移至离心管;
3. 离心后弃去上清,加入1ml优质冻存液进行重悬,转移至冻存管中;
4. 冻存管直接放入-80℃冰箱,若后期转入液氮罐,需在-80℃存放24小时以上。
细胞复苏
细胞复苏时,从液氮中取出冻存管,快速置入37℃水浴中解冻,直至冻存管中无结晶。随后擦拭管外壁进行消毒,再转移细胞至含5ml完全培养基的离心管,离心5分钟处理。弃去上清后,用完全培养基重悬并接种至新的培养瓶中,继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养。
注意事项
在运输过程中,细胞可能会因贴壁不牢而脱落,这是正常现象。如脱离较多,应将培养液收集,并进行必要的处理。通过适当的操作,可以确保细胞在尊龙凯时品牌的培养和冻存方法下健康成长。